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人血管内皮生长因子A(VEGF-A)ELISA试剂盒实验使用说明书
BS-9809人血管内皮生长因子A(VEGF-A)ELISA试剂盒
一、产品概述
本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)，专用于检测人血清、血浆、组织匀浆、细胞培养上清等样本中的VEGF-A浓度。仅供科研使用。
二、试剂盒组成
预包被微孔板?：12孔×8条(96孔规格)或12孔×4条(48孔规格)，预包被抗VEGF-A捕获抗体。
标准品?：冻干粉，需用标准品稀释液复溶后倍比稀释(建议浓度梯度：10、3.33、1.11、0.37、0.12、0.04、0 ng/mL)。
检测抗体-HRP?：辣根过氧化物酶标记的抗VEGF-A抗体。
洗涤缓冲液?：20×浓缩液，需用蒸馏水按1:20稀释。
底物溶液?：TMB显色液A/B，使用前1:1混合，15分钟内用完。
终止液?：2M溶液。
样本稀释液?：用于稀释高浓度样本。
封板膜?：2张，用于温育时密封微孔板。
三、实验原理
VEGF-A与预包被捕获抗体结合，形成“抗体-抗原"复合物;加入HRP标记检测抗体后，形成“夹心结构"。经洗涤去除未结合物质，加入TMB底物显色(蓝色)，终止液终止反应后变黄色。450nm波长测定吸光度(OD值)，浓度与OD值呈正比。
四、实验步骤
样本准备?
血清/血浆：离心去除颗粒物，避免溶血;2-8℃保存≤48小时，长期保存需-20℃/-80℃(避免反复冻融)。
细胞上清：离心取上清，避免含高浓度蛋白酶剂。
试剂准备?
洗涤液：浓缩洗涤液室温结晶时，40℃水浴溶解后按1:20稀释。
标准品：复溶后倍比稀释，现配现用。
底物：TMB A/B液1:1混合，避光保存。
操作流程?
加样?：每孔加入100μL标准品/样本，37℃孵育90分钟。
洗涤?：甩干孔内液体，用洗涤液浸泡1分钟/次，重复3次。
加检测抗体?：每孔加入100μL HRP标记抗体，37℃孵育60分钟。
洗涤?：同步骤2。
显色?：每孔加入90μL TMB底物，37℃避光孵育15-20分钟。
终止?：每孔加入100μL终止液，混匀后30分钟内测定OD值。
结果计算?
以标准品浓度(ng/mL)为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线。
根据样本OD值代入曲线计算浓度，乘以稀释倍数得结果。
五、注意事项
试剂保存?：未使用试剂盒需2-8℃避光保存，有效期6个月;复溶标准品可分装冻存，避免反复冻融。
样本处理?：避免使用含的样本，防止HRP活性。
操作规范?：移液需，避免气泡;洗涤需，防止交叉污染。
安全防护?：终止液含强酸，需戴手套操作。
六、预期结果
灵敏度?：≤1.54 pg/mL(实际以说明书为准)。
检测范围?：典型范围为3.12-200 pg/mL，部分试剂盒扩展至62.5-2000 pg/mL。
重复性?：板内/板间变异系数分别<10%和<15%。
七、常见问题解答
Q?：显色过浅或过深?
A?：调整样本稀释倍数或孵育时间;确保底物新鲜配制。
Q?：标准曲线线性差?
A?：检查复溶操作，避免气泡;更换移液器吸头。
注：以上仅供参考，本产品仅供科研使用，不作为实际数据，实验需严格遵循说明或咨询技术老师。
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